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微生物檢測中菌懸液不會制備,化驗結果怎么能保證準確?



錄入時間:2021-9-26 15:13:31 來源:LabPTP能力驗證平臺

一、操作流程

  這里以大家最常用的大腸埃希菌為例,其它菌種方法類似。

  1.菌種制備從菌種保藏管中吸取少量菌液,轉接到新鮮的TSB中,于30℃-35℃培養箱中培養18-24小時。

  2.稀釋取步驟1的培養物1mL,加入到9mL的pH7.0氯化鈉蛋白質緩沖液中,進行倍比稀釋。

  3.平板計數取稀釋好的菌液,一般取3個稀釋級,每個梯度取2mL,分別加入兩塊90cm的平皿中,每皿加入1mL菌液,傾注45℃左右的已經經過確定的TSA培養基,輕輕搖勻,靜置,培養基凝固后,置30-35℃培養箱中倒置培養48小時。

  4.菌落計數將培養后的平板,置于菌落計數器下進行菌落計數,以確定哪個稀釋級的濃度能夠滿足測試的要求。


二、注意事項

  1.菌種制備也可以使用TSA平板進行培養,如果轉接的是冷凍保藏管中的菌,最好再轉接一次,使用第二次轉接的菌種。

  2.稀釋取菌液的時候,需要先對菌液進行振蕩或吹打混勻,方可吸取菌液?梢圆挥眠M行倍比稀釋,只要能保證最后加入到測試樣品中的菌的數量符合要求即可。

  3.平板計數:取菌液時同樣需要先將試管中的菌液進行混勻。

  4.培養基菌落計數不建議逐日觀察結果,因為平板中可能有凝集水, 逐日觀察拿動平板,可能會導致水落到菌落上,菌跟著水流到下一個空白地方,導致結果不準確;另外如果是霉菌,因為有孢子,拿動也會導致孢子落到平板空白地方,影響結果。


三、事后思考

  1.菌液的作用

  菌懸液使用有時效性要求

  2020版《中國藥典》和《歐洲藥典》8.0版要求如果放置在室溫,菌懸液必須在2小時內使用,如果放置在2-8℃保存,可以在24小時內使用。

  那么問題來了,菌懸液的菌的數量需要在48小時后才能確定,但是在24小時之內菌懸液必須使用,所以在不知道菌含量的情況下,樣品測試需要做至少三個梯度。

  筆者之前在微生物實驗室做了5次的菌懸液制備,為了保證實驗的成功,每次都是要做三個梯度,雖然大多數都是同一個稀釋級的含量符合要求,但是還是偶爾有另一個稀釋級才符合要求的時候,所以筆者每次都乖乖的做三個梯度的測試,還好筆者那個時候依據的法規中,日常的無菌檢查和控制菌檢查中沒有陽性對照的要求。

  這里說的三個梯度不是說只是計數,而是菌懸液實際運用的測試中也需要三個梯度,舉個例子,某個無菌產品無菌檢查中的陽性對照測試,需要做三個對照。當然,同樣的產品方法適用性,培養基促生長測試也是如此。流程圖如下:

  2.步驟的繁瑣

  這個流程圖中,還是省略了一些步驟,一句話帶過的倍比稀釋,做過的小伙伴們知道,這個說起來容易做起來難。

  另外在接收菌種和從冷凍保藏管中取出菌種來使用時,還需要進行相應的鑒定,所以不要覺得這個流程好冗長,其實已經是簡單版的。

 

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