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常用菌種的傳代與保存方法

王娟
錄入時間:2021-9-27 13:50:04 來源:青島海博生物

一、菌株概念及傳代

  (1)標準菌株:直接從官方菌種保藏機構獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。通常默認為第0代菌株。

  (2)標準儲備菌株:將標準菌株在實驗室轉接一代后得到的一套完全相同的獨立菌株。通常為第1代或第2代菌株。

  (3)儲備菌株:從標準儲備菌株轉接一代獲得的培養物。通常為第2代或第3代菌株。

  (4)工作菌株:由標準儲備菌株、 儲備菌株或標準物質(經證明或未經證明) 轉接一代獲得的菌株。通常為第3-5代菌。

  傳代:每一次的轉接培養都是一次傳代的過程,可以使用液體、固體或半固體培養基。

  注意事項:菌株傳代只能由上往下傳,儲備菌株可以做為工作菌株使用,但工作菌株不能做為儲備菌株使用。實驗室使用的工作菌株一般不可超過第5代,除非標準方法中有明確要求,或實驗室能夠證明菌株相關特性沒有改變。若在傳代過程中出現明顯變異,也不可繼續使用。


二、菌種保存的基本原理

  使微生物的生命活動處于半永久性的休眠狀態,也就是使微生物的新陳代謝作用限制在最低范圍內。干燥、低溫和隔絕空氣是保證獲得這種狀態的主要措施。有針對性地創造干燥、低溫和隔絕空氣的外界條件,就是微生物菌種保藏的基本技術。


三、菌種保存的常用方法
  (1)斜面保存法
  操作方法:將營養瓊脂(或其他適宜的瓊脂培養基)加熱煮沸溶解后分裝至試管中,滅菌后擺長斜面凝固,挑取菌落“之”字形劃線接種至培養基斜面,置于合適的條件中進行培養。培養結束后,置2-8℃冷藏保存(部分菌株會在4℃產生自溶,如銅綠假單胞菌。副溶血性弧菌等,可置室溫保存)。
  此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法,操作簡單,使用方便,但易變異,屢次傳代會使微生物的代謝改變,而影響微生物的性狀,污染雜菌的機會亦較多。霉菌、酵母菌、放線菌和芽孢菌一般保存2-4個月傳代一次,細菌一般保存一個月傳代一次。

斜面保存法

  (2)液體石蠟保存法
  操作方法:將營養瓊脂(或其他適宜的瓊脂培養基)加熱煮沸溶解,分裝至試管中滅菌后擺長斜面,或使用半固體培養基加熱煮沸溶解后分裝至小試管,滅菌后擺直立,挑取菌落“之”字形劃線接種至培養基斜面或穿刺接種至半固體培養基管,置于合適的條件中進行培養。培養結束后,在培養基表面覆蓋一層無菌液體石蠟,2-8℃冷藏保存。
  液體石蠟一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡,另一方面可阻止氧氣進入,以減弱代謝作用。此法比斜面保存法的保存期限更長,霉菌、酵母菌、放線菌、芽孢菌可保存1-2年甚至更長時間,多數無芽孢菌也可保存到一年以上。
(3)甘油凍存保存法
  操作方法:挑取菌落至液體菌種保存管中(商品化的液體菌種保存管中已加入甘油,直接使用即可;若自行配制,可在凍存液中加入15%-50%比例的甘油,或將菌液與無菌甘油溶液混合),用移液槍吹打均勻,制成約109CFU/mL的菌懸液,置于超低溫冰箱中或液氮罐中冷凍保存(霉菌可挑取孢子凍存,保存溫度越低效果越好,長期保存建議在-70℃以下凍存)。
  該方法適用范圍廣,操作簡便,效果好,無變異現象發生。-20℃保存時間較短,一般可保存一年左右,-70℃以下可保存較長時間,一般至少可保存兩年以上,有些菌種甚至可保存十年以上。
  注意事項:反復凍融易導致菌株死亡,在中國藥典中規定,融化后的菌種保存管不可再進行冷凍保存。
液體菌種保存管(含甘油)
  (4)真空冷凍干燥保存法
  通常以牛奶為載體,加入菌株制成菌懸液,使用真空凍干機器進行脫水凍干處理,制成凍干粉。相比較于其他保存方法,真空冷凍保存法更容易保存菌種的活力,延長保存時間,適用于98%以上菌種的保存,但操作復雜,一般實驗室難以使用。
  (5)載體保存法
  以沙土、濾紙、硅膠等材料做為載體吸附菌株,通過五氧化二磷干燥保藏的方法。保藏時間長,應用較為廣泛,但一般實驗室通常不易操作。
  (6)瓷珠保存法
  瓷珠菌種保存管是實驗室保存菌種的容器,管內有表面凹孔小瓷珠用于細菌的吸附和保存,甘油做為抗凍保護劑可減少冷凍過程中形成的冰晶,瓷珠菌種保存管放置于-20℃或-80℃下便可創造干燥、低溫、缺營養的環境,使菌株處于“休眠” 狀態,方可長期保存(視不同菌種與保存溫度,一般可保存3-10 年),同時菌種保存管的取用和保存較為便利(取用復蘇及保存菌株僅需1 分鐘)。
  保存方法:挑取平板或斜面上的新鮮純培養物于菌種保存管中,配成大約3-4麥氏比濁度的菌懸液,蓋上蓋子來回顛倒幾次使細菌乳化,用無菌移液器將菌種保存管內的液體吸取干凈,僅留下瓷珠,擰緊保存管,迅速將其置于-20℃或-70℃冰箱中。
  使用方法:無菌條件下,用滅過菌的針或者鑷子取出一個小瓷珠,將小瓷珠直接用作平板劃線或加到合適的液體培養基中,置合適的條件下進行培養即可。
瓷珠菌種保存管


四、實驗室常用菌種的保存方法

  (1)短期、中期保存:葡萄球菌、沙門氏菌、埃希氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、假單胞菌、李斯特氏菌等,可使用營養瓊脂斜面或TSA斜面4℃保存(銅綠假單胞菌在4℃會出現自溶,可以置室溫保存),通?杀41-3個月。白色念珠菌、酵母菌、霉菌等可使用沙氏葡萄糖瓊脂斜面4℃保存,通?杀43-6個月。生孢梭菌、產氣莢膜梭菌可使用皰肉培養基培養后置4℃保存,可存活數月至1年以上。
  (2)長期保存:對于大多數的細菌、真菌,普通實驗室都可以選用瓷珠保存法或甘油保存法置-20℃以下或-70℃以下凍存,溫度越低保存時間越長。(注:保存霉菌時挑取孢子凍存即可;保存厭氧菌建議使用甘油保存法,避免反復凍融;使用甘油凍存法保存彎曲桿菌、螺桿菌、嗜血桿菌等細菌時,加入5%-10%比例的脫纖維羊血效果更佳)。


注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。


 

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